天天熱點(diǎn)！甲基化分析 診斷 什么?。谆治觯?/h1>
1、基因甲基化的檢測(cè)方法主要有以下幾種：甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。
(資料圖片)
2、通過(guò)電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說(shuō)明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，說(shuō)明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。
3、2、亞硫酸氫鹽測(cè)序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。
4、隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過(guò)程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測(cè)序方法。
5、將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測(cè)序，可以提高測(cè)序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測(cè)序法。
6、3、甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)MSAP是利用對(duì)DNA甲基化敏感的兩種同裂酶Hpa II和Msp I來(lái)對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切和連接。
7、由于兩種酶能夠識(shí)別相同的限制性酶切位點(diǎn)，即CCGG位點(diǎn)。
8、當(dāng)DNA序列中的CCGG位點(diǎn)出現(xiàn)不同程度的甲基化狀態(tài)時(shí)，會(huì)分別被這兩種酶識(shí)別，以有無(wú)產(chǎn)物的方式體現(xiàn)出來(lái)。
9、4、焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)通過(guò)準(zhǔn)確定量單個(gè)連續(xù)的CpG 位點(diǎn)上的甲基化頻率，焦磷酸測(cè)序能檢測(cè)并定量甲基化水平上的細(xì)微改變。
10、在序列延伸過(guò)程中，根據(jù)C和T的摻入量來(lái)定量確定單個(gè)位點(diǎn)的C-T比例。
11、因此，不同位點(diǎn)的甲基化變異就能被準(zhǔn)確檢測(cè)。
12、由于焦磷酸測(cè)序提供了真實(shí)的序列數(shù)據(jù)，甲基化狀態(tài)也就以序列形式呈現(xiàn)。
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